Рецептор MT2 является основным типом рецептора, связанного с G-белком, который в основном опосредует эффекты мелатонина. Дефицит передачи сигналов мелатонина / MT2 был обнаружен при многих неврологических расстройствах, включая болезнь Альцгеймера, наиболее распространенную причину деменции у пожилых людей, предполагая, что сохранение рецептора MT2 может быть полезным для этих неврологических расстройств. Тем не менее, прямые доказательства, связывающие рецептор MT2 с синаптической пластичностью, связанной с познанием, еще предстоит установить. Здесь мы сообщаем, что рецептор MT2, но не рецептор MT1, необходим для аксоногенеза.in vitroиin vivo. Мы обнаружили, что образование аксонов замедляется у мышей с нокаутом рецептора MT2, электропорированных срезов мозга MT2-шРНК или первичных нейронов, обработанных селективным антагонистом рецептора MT2. Активация рецептора MT2 способствует аксоногенезу, что связано с усилением возбуждающей синаптической передачи в центральных нейронах. Сигнальные компоненты после рецептора MT2 состоят из Akt/GSK-3β/Каскад CRMP-2. Мотив С-концевого рецептора MT2 напрямую связывается с Akt. Либо ингибирование рецептора MT2, либо нарушение связывания рецептора MT2 с Akt снижает аксоногенез и синаптическую передачу. Наши данные свидетельствуют о том, что рецептор MT2 активирует Akt/GSK-3β/CRMP-2 сигнализирует и необходим и достаточен для опосредования функционального аксоногенеза и синаптического образования в центральных нейронах.
Синаптические цепи устанавливаются в местах аксон-дендритного, аксон-соматического или аксон-аксонального контакта, в которых функциональный аксоногенез является критическим этапом. Аксоногенез может регулироваться многими внутриклеточными сигналами, которые включают цитоскелетные перестройки, локальную деградацию белка, а также диффузионные барьеры. Кроме того, было показано, что несколько внеклеточных нейротрофических факторов и гормонов играют роль в руководстве аксонами и синаптическом образовании в центральных нейронах. На сегодняшний день роль мелатонина и его рецепторов в аксоногенезе остается неясной. Большинство биологических функций мелатонина опосредованы двумя его рецепторами, рецепторами MT1 и MT2, оба они принадлежат к подсемейству рецепторов, связанных с G-белком (GPCR), и широко экспрессируются во всей центральной нервной системе (ЦНС). Активация рецептора MT2 в ответ на мелатонин имеет решающее значение для контроля циркадных ритмов и регуляции медленного сна. Ранние исследования показали, что активация рецептора MT2 в сетчатке снижает высвобождение дофамина, в то время как дофамин ингибирует подвижность конуса роста и рост нейритов во время эмбрионального развития, предполагая участие рецептора MT2 в функциональном аксоногенезе. У мутантных мышей с недостаточной экспрессией гена MT2 индукция долгосрочного потенцирования (LTP) возбуждающей синаптической передачи нарушена, и это нарушение тесно связано с дефицитом обучения. В гиппокампе рецептор MT2 ингибирует опосредованный рецептором ГАМК ток, который участвует в синаптической передаче. При болезни Альцгеймера экспрессия рецептора MT2 значительно снижается, особенно в гиппокампе. Частичный агонист рецептора MT2, UCM765, проявляет анксиолитические свойства, увеличивая время, проведенное в открытой руке повышенного плюс-лабиринтного теста, и уменьшая латентность для еды в новой среде в тесте на питание с подавленной новизной, предполагая его роль в тревоге. Вместе эти результаты свидетельствуют о том, что рецептор MT2 связывает сигнальные каскады, которые опосредуют обучение и формирование памяти, одну из важных биологических функций мелатонина; однако клеточные и молекулярные события, лежащие в основе этой связи, еще предстоит установить.
Диссоциированные нейроны гиппокампа обычно используются как отличныеin vitroмодель в изучении развития аксонов и синаптической передачи, поскольку они поддерживают морфологические, функциональные и молекулярные характеристики нейронов гиппокампаin vivo.В диссоциированных нейронах гиппокампа переход к образованию и созреванию аксонов включает следующие пять стадий: нейроны стадии 1 (~ 2-4 ч после покрытия) демонстрируют обильные ламеллиподии и филоподии, которые развиваются в несколько незрелых коротких нейритов на стадии 2 (~ 12-24 ч); поляризация происходит на стадии 3 (~ 24-48 ч), на которой один нейрит инициирует быстрое удлинение, чтобы стать аксоном, в то время как другие приобретают дендритную идентичность; 4 стадия (~3–4 дня) характеризуется быстрым ростом аксонов и дендритов; а на стадии 5 (7 дней и далее) созревание аксонов и дендритов имеет важное значение для формирования функциональных синапсов. В настоящем исследовании мы определили новую роль рецептора MT2 в функциональном аксоногенезе и показали, что активация рецептора MT2 имеет решающее значение для функционального аксоногенеза и синаптической передачи в центральных нейронах. Используя флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET) в сочетании с пептидными блокирующими анализами, мы идентифицировали Akt как взаимодействующего партнера и субстрат рецептора MT2. Активация сигнального каскада рецептора MT2-Akt способствует образованию функциональных синапсов в гиппокампе, тогда как ингибирование рецептора MT2 останавливает аксоногенез и синаптическую передачу. Учитывая влияние рецептора MT2 на обучение и память, мы предполагаем, что нацеливание на передачу сигналов рецептора MT2 может быть осуществимой стратегией для стимуляции сборки функциональной синаптической цепи.
Накопление рецептора МТ2 в поляризованных аксонах
Чтобы изучить роль рецепторов MT1 и MT2 в развитии аксонов, мы сначала измерили их клеточную локализацию в диссоциированных нейронах гиппокампа крыс путем совместного иммуностайнизации рецептора MT1 или рецептора MT2 и Tuj1, нейрон-специфического класса III.β- тубулин. Мы обнаружили, что рецептор MT2 был равномерно распределен на всех нейритах с обогащением наконечника в нейронах стадии 2, в то время как сильный флуоресцентный сигнал был обнаружен только на поляризованной кончике аксона, но не в дендритах в нейронах стадии 3. Количественный анализ показал, что рецептор MT2 дифференциально обогащался на кончиках нейритов в нейронах стадии 2, тогда как более эксклюзивное обогащение кончика аксона рецептором MT2 наблюдалось в нейронах стадии 3. Рецептор MT1 имел аналогичное распределение с рецептором MT2 на стадии 2, но на стадии 3 не было обнаружено поляризованного распределения рецептора MT1. Специфичность антитела рецептора МТ2 была подтверждена экспериментом по блокированию пептидов. Эти результаты свидетельствуют о том, что рецептор MT2 может играть потенциальную роль в дифференцировке аксонов, ранней стадии развития синапсов.